### 破骨细胞诱导分化机制

破骨细胞是一种独特的多核细胞，来源于造血干细胞分化而来的巨噬细胞，专门负责骨吸收过程。RANKL/RANK/OPG信号通路是调控破骨细胞分化的核心，要精细调控破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，以确保骨骼稳态。

### 信号通路的调控作用

在诱导破骨细胞的活化和失活过程中，核因子κB受体活化因子配体（RANKL）被认为是破骨细胞分化成熟及其功能活性的最重要因素。M-CSF可以诱导RANK在破骨细胞前体的细胞膜上表达，从而促使这些细胞与RANKL结合，进而诱导破骨细胞的分化。由于破骨细胞在体内的数量非常有限，仅占分离细胞的0.8%-1.2%，且在体外分离培养较为困难，因此目前主要采用诱导法，常用的方法包括骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

### 骨髓单核细胞诱导法步骤

以下为骨髓单核细胞诱导法的详细步骤：

1. 选用8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法处理后，浸泡在50mL 75%乙醇中进行消毒。
2. 在无菌操作下完整取下小鼠后肢，剔除股骨和胫骨的多余皮肤与肌肉组织，然后将骨头置于10mL含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液中（4℃预冷）。
3. 分离胫骨和股骨，用含2%青霉素-链霉素的PBS溶液清洗两次，每次5分钟，确保无菌操作以避免污染。
4. 使用注射器向骨头两端注入α-MEM，冲洗出骨髓细胞，然后通过70μm细胞筛网过滤到50mL离心管中。
5. 在室温下以400×g离心5分钟，弃去上清液，加入3mL红细胞裂解缓冲液静置2-3分钟以裂解红细胞。
6. 加入5mL含10% FBS的α-MEM培养基终止裂解，并进行300×g离心3分钟，弃上清液。
7. 将细胞重悬于20mL含20-50ng/mL M-CSF(CB34)的完全培养基中，转移至两个10cm培养皿，在37℃、5% CO₂培养箱中过夜。
8. 收集未贴壁细胞，接种到10cm培养皿中继续培养并更换培养基。
9. 8小时后收集骨髓细胞，以终浓度为16-20×10⁶cells/mL接种到24孔板中。
10. 通过TRAP染色鉴定破骨细胞，并确保在诱导成熟后尽快进行染色，以避免破损。

### RAW264.7细胞系诱导法

RAW264.7细胞系诱导法的步骤如下：

1. 细胞培养于含10% FBS的DMEM中，维持在37℃、5% CO₂下，并每隔一天更换培养基。
2. 当细胞汇合度达到80%-90%时，轻轻将细胞收集，避免使用胰酶消化。
3. 用含10%FBS的α-MEM培养基将RAW2647细胞制成悬液，以2×10⁴cells/孔的密度接种于24孔板中。
4. 细胞接种12小时后，加入100-150ng/mL RANKL(C28A)。
5. 每3天更换培养基，并补加RANKL。
6. 多核破骨细胞将在分化培养4天后开始出现，5-6天时逐渐丰富。
7. 通过TRAP染色鉴定破骨细胞。

### 品牌优势

南宫28NG相信品牌力量，为您提供高活性、高一致性的重组M-CSF和RANKL蛋白，帮助您稳定高效地诱导破骨细胞。通过这些高质量的蛋白质，您可以显著提高实验的成功率，确保研究的可靠性和一致性。

### 产品数据

高活性重组M-CSF和RANKL蛋白在细胞增殖实验中表现出优异的效果，助力骨细胞分化研究。